È fin d’allora fidato consigliere di papa Clemente XII.

Il suo episcopato bolognese è caratterizzato dalle visite pastorali alle parrocchie e dalle notificazioni indirizzate al clero.Visita frequentemente anche l'Istituto delle Scienze.

In conclave

18 febbraio – 17 agosto 1740

Ci sono 68 cardinali. 51 di essi prendono parte allo scrutino finale che porta all’elezione di Benedetto XIV. 4 cardinali muoiono durante la sede vacante.
1. Pietro Ottoboni, vescovo di Ostia e Velletri, canonico del Sacro Collegio dei Cardinali, segretario del S.C. del Sant’Uffizio (si ammalerà e lascerà il conclave il 25 febbraio. Morirà il 29 febbraio.)
2. Tommaso Ruffo, vescovo di Porto e Santa Rufina.
3. Annibale Albani, vescovo di Sabina.
4. Giovanni Battista Altieri vescovo di Palestrina (morirà in conclave il 13 Marzo 1740.)
5. Ludovico Pico della Mirandola, vescovo di Albano.
6. Pier Marcellino Corradini, vescovo di Frascati.
7. Thomas Philip Wallrad d'Hénin-Liétard d'Alsace-Boussu de Chimay, arcivescovo di Mechlin, Belgium.
8. Luis Antonio Belluga y Moncada (uscirà dal conclave perché malato l’8 marzo 1740. Vi rientrerà il 24 marzo.)
9. Vincenzo Petra
10. Vincenzo Ludovico Gotti, O.P.
11. Pierluigi Carafa.
12. Francesco Scipione Maria Borghese.
13. Vincenzo Bichi.
14. Antonio Saverio Gentili.
15. Giovanni Antonio Guadagni, O.C.D., vescovo di Arezzo.
16. Troiano Acquaviva d'Aragona.
17. Pompeo Aldrovandi.
18. Giuseppe Spinelli, arcivescovo di Napoli.
19. Joseph Dominicus von Lamberg, vescovo di Passau.
20. Domenico Passionei.
21. Pierre Guérin de Tencin, arcivescovo di Embrun, Francia.
22. Alessandro Albani.
23. Neri Maria Corsini.
24. Bartolomeo Ruspoli.
25. Carlo Rezzonico.
26. Marcellino Corio.
27. Prospero Colonna.
28. Carlo Maria Sacripante.
29. Nicolò Coscia.
30. Giuseppe Accoramboni.
31. Bartolomeo Massei.
32. Nicolò del Giudice.
33. Domenico Riviera.
34. Marcello Passari.
35. Francesco Antonio Finy.
36. Prospero Lorenzo Lambertini, vescovo di Ancona.
37. Giovanni Battista Spinola.
38. Pietro Maria Pieri, O.S.M.
39. Carlo Vincenzo Maria Ferreri Thaon, O.P vescovo di Alessandria.
40. Rainiero D'Elci, arcivescovo di Ferrara.
41. Carlo Maria Marini.
42. Armand Gaston Maximilien de Rohan de Soubise, vescovo di Strasbourg, Alsace.
43. Giuseppe Firrao, arcivescovo di Aversa (Segretario di Stato di Clemente XII).
44. Nicolò Maria Lercari.
45. Henri-Osvald de la Tour d'Auvergne de Bouillon, arcivescovo di Vienne, France.
46. Giacomo de Lanfredini.
47. Sigismund von Kollonitsch, arcivescovo di Vienna, Austria.
48. Agapito Mosca.
49. Gaetano Stampa, arcivescovo di Milano.
50. Philip Ludwig von Sinzendorf vescovo di Györ, Hungary.
51. Silvio Valenti Gonzaga, legato in Bologna (diventerà il Segretario di Stato di Benedetto XIV).
52. Camillo Cybo.
53. Angelo Maria Quirini, O.S.B.Cas., vescovo di Brescia.

I seguenti cardinali non parteciparono al conclave:
54. Lorenzo Altieri.
55. Nuno da Cunha de Attaíde.
56. Melchior de Polignac.
57. Benedetto Odescalchi Erba.
58. Giulio Alberoni.
59. Léon Potier de Gesvres.
60. Damian Hugo Philipp von Schönborn Bushein,vescovo di Speyer and Konstanz.
61. André-Hercule de Fleury, primo consigliere di stato di Francia.
62. João da Motta e Silva.
63. Luis Antonio Jaime de Borbón y Farnesio, Infante Reale di Spagna.
64. Thomas de Almeida, patriarca di Lisbona, Portogallo.
65. Gaspar de Molina y Oviedo, O.E.S.A., vescovo di Málaga,Spagna.
66. Jan Aleksander Lipski, vescovo di Crácow, Polonia.

I seguenti altri cardinali morirono durante la sede vacante:

• Leandro di Porzia, O.S.B.Cas. (+ 2 o 10 giugno 1740.)
• Serafino Cenci, arcivescovo di Benevento (24 giugno 1740).

Il Collegio era all'inizio diviso in due gruppi, quello mosso dalla Spagna, guidato dal Cardinal Acquaviva, e quello franco-austriaco capeggiato dai cardinali Tencin e Giudice. All'inizio i voti vennero convogliati sul cardinal Ottoboni che però morì il 28 febbraio; poi i candidati furono Neri Corsini e Annibale Albani ma essendo riconducibili a questa o quella potenza straniera subivano il veto incrociato delle altre. Uno dei favoriti, Pier Marcellino Corradini, cardinale vescovo de Frascati, aveva subito il veto del re Filippo V di Spagna V. Successivamente il compromesso fu sul Cardinal Pompeo Aldobrandini ben visto dalle Potenze, ma mancava sempre un voto. Si dice che alla fine il cardinal Lambertini disse ai colleghi, ormai sfiniti: «Se volete un santo prendete Gotti (Vincenzo Ludovico Gotti, cardinale del titolo de S. Pancrazio e patriarca titolare di Gerusalemme); se volete un politico scegliete Aldovrandi (Pompeo Marescotto Aldovrandi, cardinale del titolo de S. Eusebio e arcivescovo-vescovo di Montefiascone-Corneto); se volete un buon uomo prendete me» (ma alcuni dicono che l'espressione vera fu "un coglione"). I cardinali presero Lambertini in parola: alla fine, la mattina del 17 di agosto 1740, al 255° scrutinio, egli risultò vincitore con tutti e 51 i voti. Precedentemente non aveva mai avuto un voto. Richiestogli, secondo l'usanza, se accettasse o meno, rispose affermativamente e per tre ragioni: "La prima: per non dispregiare un vostro benefizio; la seconda: per non resistere alla volontà manifesta di Dio, poiché tale la ritengo non avendo mai io desiderato così eccelsa vanità; la terza: per finire queste nostre adunanze che credo servano di scandalo al mondo per la loro durata"

È stato cardinale per 13 anni e 7 mesi

Ordina la revisione del processo contro Niccolò Paolo Andrea Coscia, cardinale del titolo pro illa vice de S. Maria in Dominica e arcivescovo di Benevento, che era stato condannato dal predecessore Clemente XII per reati economici. Coscia viene finalmente assolto e restituito ai suoi incarichi.

Fonda le diocesi di São Paulo e di Mariana in Brasile.

La profezia di San Malachia attribuisce a Benedetto XIV il motto Animal rurale: forse un riferimento alla sua origine rurale (forse al suo carattere rustico e diretto) o meglio al fatto che fu un gran lavoratore, quasi un animale da soma.